Comment utiliser un pistolet à gènes

1. Préparation du matériel

Une mince couche de milieu a été placée sur une boîte de culture de 9 cm2 et le matériel (embryons généralement immatures, embryons matures, petits callosités, cellules en suspension, protoplastes, etc.) a été plaqué au centre de la boîte d'un diamètre de 3 cm. .

2, le traitement de la poudre d'or

Prendre 60 mg d'or en poudre ou de tungstène en poudre dans un tube à centrifuger, ajouter 1 ml d'éthanol absolu, bien agiter pendant 3 min, centrifuger pendant 1 minute à 9615 g, retirer le surnageant, ajouter 1 ml d'eau stérile et bien mélanger, centrifuger à 9615 g et répéter l'étape 3 ci-dessus. Fois. Enfin, la poudre d'or a été mise en suspension dans 1 ml d'eau distillée stérile et stockée à 4 ° C ou à la température ambiante.

3, traitement de l'ADN

Prendre une suspension de poudre d'or 50tA, ajouter une solution de 5ème ADN plasmidique (1,0 / lg ~ 1), 50 // l

0,1 mol / L de spermidine (la solution utilisée a été stérilisée-stérilisée), agité pendant 3 min, laissé à température ambiante pendant 10 min, centrifugé à 9615 g pendant 10 s, jetez le surnageant; ajouter 250 ~ 1 d'éthanol absolu, agiter à la centrifugeuse à 9615 g pendant 10 s et jeter le surnageant. Le culot a été remis en suspension dans 60/1 1 d'éthanol absolu et utilisé pour 5 injections (10 à 1 par injection).

4, le fonctionnement du canon à gènes

Toutes les opérations du pistolet à gènes sont effectuées dans des conditions d'asepsie, comme suit:

1) Désinfectez la surface du canon à gènes et la chambre d’échantillon avec 70% d’éthanol. En même temps, le filet de protection et le disque pouvant être scindé, le support micro-élastique, son support et l’outil de fixation ont été trempés pendant 15 minutes avec de l’éthanol à 70%, puis placés pour sécher. Le diaphragme scindable, le couvercle fixe et le dispositif de lancement à support micro-élastique peuvent être stérilisés en surface avec de l'éthanol à 70% et séchés par soufflage.

2) Insérez la lame de microparticules dans l'anneau de retenue, ajoutez un mélange d'ADN et de poudre d'or au centre de la lame de microparticules et laissez sécher pendant environ 1 minute.

3) Installez la membrane déchirable sur son support et tournez-la dans le sens des aiguilles d'une montre sur l'accélérateur de gaz.

4) Installez la bague d’espacement, le filet de blocage, le support de filet de blocage, le support de particules et la bague de fixation (face avec les particules dirigées vers le bas), serrez le couvercle et insérez-le dans le grappin.

5) Placez l'échantillon dans la chambre de bombardement et fermez la porte.

6) Ouvrez la vanne principale du cylindre d'hélium et tournez la vanne de régulation d'hélium dans le sens des aiguilles d'une montre pour que l'indication de l'indicateur du manomètre soit supérieure à la pression du diaphragme 200 psi (= 1,379MPa).

7) Allumer le pistolet à gènes et le commutateur du transformateur.

8) Appuyez sur le bouton de vide. Lorsque le vide est de 26 à 28 pouces de mercure (= 88,05 à 94,82 kPa), appuyez rapidement sur le bouton Hold, puis maintenez enfoncé le bouton de lancement et maintenez-le jusqu'à son activation.

9) Appuyez sur la touche d'aération pour réinitialiser l'échantillon une fois la table de vide mise à zéro.

10) Arrêtez.

Serrez l'interrupteur principal du cylindre d'hélium, frappez un pistolet vide, ramenez le pointeur du manomètre à zéro, puis tournez la valve de réglage du manomètre dans le sens anti-horaire; éteignez l'interrupteur principal du pistolet à gènes et l'interrupteur du transformateur.